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1. 构建重组载体时用两种限制酶切割目的基因的原因

1、构建重组载体时用两种限制酶切割目的基因的原因

为了防止目的基因和运载体自身环化。为保证目的基因正序插入运载体，防止反向连接。限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。

切割目的基因时同种序列当然可以用同种限制酶切割；但有时也用不同种的限制性酶割。用不同限制酶切割的目的是：保证目的基因和质粒（运载体）的准确连接，避免无效连接（如：目的基因—目的基因连接物、质粒自身环化等）过多。

用两种酶是为了得到链状的目的基因，一般是不用一种酶的，比如一种限制性内切酶可以得到 ---TA 的末端，因为DNA是双链，那么目的DNA的两端就可以形成互补（这里由于版面的关系我就不表示出来了，你自己简单的画个示意图就明白），产生一个环状的DNA分子，就很难用于研究了。

双酶切就是为了验证是否有目的基因，如果双酶切条带正确，而且PCR也没有问题，就可以确定质粒构建成功。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

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