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1. 大片段载体的分段构建二(两步PCR法)

1、大片段载体的分段构建二(两步PCR法)

首先一下是基因的全长，根据预实验结果，在红线那个位置分隔开，将其分成1-3010的 a 段及3011-6810的 b 段两个片段。一般来说4kb以下还是很好构建的。在设计引物时，需要将A片段的末尾和B片段的起始处设计出 15bp大小的重合序列（coincide），第一次PCR得到A、B两个片段，如图有15bp的重合序列。

载体构建的基本流程主要包括目的基因的获取、载体的选择和准备、目的基因与载体的连接、重组子的筛选与鉴定以及重组载体的扩增和纯化等步骤。首先，要进行目的基因的获取。这是载体构建的第一步，也是最关键的一步。可以通过PCR扩增、基因文库筛选、化学合成等方法获取目的基因。

一步法，使用特殊引物，全程只设置一个温度即可完成扩增。这种特殊引物有专利。二步法即循环扩增中设置2个步骤，这个方法主要扩增短片段，一个是95度变性，另一个是退火与扩增的温度，一般设置在55~60之间，当然也有例外。三步法就是平常见到的方法，扩增循环有三步，变性，退火，延伸。

设计一对引物，针对基因两端（覆盖酶切位点），在上游引物中酶切位点后的一段序列中添加一个碱基，扩增以后，酶切产物和空载体，再连接一遍，转化，小提拿去测序。最好上游换另一个内切酶位点，这样方便双酶切检测，区别于原来的质粒。

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