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1. [实用技巧] 构建基因过表达载体之设计引物详细步骤

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现在我们就需要把SUN片段连到一个载体，用VectorNTI打开，研究一下用哪个酶处理，这个载体需要用Sma1这个酶切开，然后用SUN连上，替换切下来的ccdb，这里要用到两个酶，一个Sma1限制性内切酶切开，一个DNA连接酶把新片段连上，植物转基因载体和这些酶都是非常常用的试剂。

突破性的突变引物设计为了包含突变，我们巧妙地调整了F2/R2引物，尽管不再严格遵循常规规则，但每一笔都关乎实验的成功。从PCR到转化PCR扩增阶段，全基因由F1/R1引物驱动，而突变区则由F2/R2驱动，图24记录了这个关键步骤。酶切pEGFP-N1： 为后续连接做好准备。

基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体， 首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。

如果t载体上没有表达载体上需要的酶切位点，就要重新设计带酶切位点的引物，PCR扩增t载体后酶切并连表达载体。如果t载体上有需要的酶切位点，直接酶切后回收目的片段，连接表达载体即可。

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