载体的构建与遗传转化-载体的构建与目的基因的导入
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1、转基因涉及的主要步骤有哪些?
载体构建:这一步骤涉及将目的基因插入到载体DNA中,以便在目标生物体中传递和表达。这通常包括目的基因的扩增和表达载体的构建。 遗传转化:在植物中,遗传转化是将重组DNA引入植物细胞的过程。常用的方法包括简单的花序浸染、农杆菌转化、基因枪轰击以及花粉管通道法等。
转化是目的基因进入受体细胞并稳定表达的过程。 导入方法根据受体细胞类型不同而异。植物细胞常用农杆菌转化法,动物细胞常用显微注射技术,微生物细胞则常用Ca2 处理法。 筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因的表达。
以植物转基因为例:载体构建;包括目的基因扩增,表达载体构建。遗传转化;最简单的花序浸染,常用的农杆菌转化、基因枪轰击,还有花粉管通道等。阳性筛选;标记基因筛选,阳性植株目的基因DNA水平PCR检测、RNA水平PCR检测、目的基因表达蛋白水平检测。功能验证。即表型分析。
表达检测:最后,必须确认目的基因是否在植物中正常表达。这涉及到多种检测技术,如热不对称交错PCR确定基因插入位置、实时PCR和西方印迹分析评估基因表达水平,以及转录组学和代谢组学分析评估基因组规模表达和产物变化。商业化的转基因植物需要确保目的基因性状得以表达,不产生有害的非目标性状。
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