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1. 如何构建一个基因的过表达载体?是要真核表达的

1、如何构建一个基因的过表达载体?是要真核表达的

当拿到一个基因的DNA片段后，就需要把它导入一个载体，一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。常用的载体有细菌质粒，噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。

确保酶切位点的适当距离，以便在载体上操作且酶活性不受影响（1）。例如，XhoI和NotI的酶切位点分别为C TCGA G和GC GGCC GC，它们的完美结合将在示意图（图9）中清晰呈现。接下来，设计PCR引物至关重要。

切割质粒和目的基因的限制酶必须是同-.种酶，以获得相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。通过载体把目的基因片段导入活细胞。

完整的表达载体必须包括：复制子，在细菌中扩增时所必须。启动子，目的基因在细菌或细胞中转录所必须，转录了才能翻译，是谓“表达”。原核筛选标记，细菌增菌所必须。真核筛选标记，如果是真核表达，就是必须的。多克隆位点，即酶切位点，插入目的片段的区域。

作为一个基因表达载体，必须要满足以下条件：细菌的复制起始位点Ori；用来对转入质粒的细菌进行筛选的抗性基因比如：Kan Amp spec 等抗性筛选基因。一个基因如果能够表达还需要启动子（promoter）、基因编码区（CDS）和终止子（terminator）。CDS区需要起始密码子ATG和终止密码子TAA。

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