构建载体质粒自连-质粒载体构建的基本原理
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1、...自体连接成一个新质粒,用什么连接,可以用连接载体和插入片段的T4盒子...
zero blunt TOPO PCR cloning KIT大概也许是不可以的,这是一个拓扑异构酶联载体,用于将平末端的PCR产物高效率的插入此载体,和你所说的自连要求不同。
连接。用T4连接酶把片段和载体连接起来,常用NEB,Fermentas等,有钱的实验室可用Roche,效果不错。转化。
首先,构建重组质粒是通过DNA连接酶,如T4噬菌体DNA连接酶或大肠杆菌DNA连接酶,将经过酶切的载体与外源DNA片段连接起来。T4噬菌体DNA连接酶可连接粘性末端和平末端,但平末端连接效率较低,通过调整酶浓度和DNA浓度可以提高效率。连接过程包括酶-ATP复合物结合DNA、DNA腺苷化和磷酸二酯键形成。
外源DNA和质粒载体的连接外源DNA片段和线状质粒载体的连接,也就是在双链DNA5;磷酸和相邻的3;羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5;磷酸,可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化,则吸能形成2个新的磷酸二酯链。
基本的亚克隆操作包含四步:首先用合适的限制性内切酶切割载体与插入片段,接着用T4DNA连接酶将DNA片段与载体连接,然后转化宿主大肠杆菌,最后筛选出含有所需结构的重组质粒。 克隆分析用于将DNA片段从一个载体(质粒、黏粒或噬菌体)转移到另一个载体上。
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