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1. 荧光素酶报告基因检测

1、荧光素酶报告基因检测

将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。

②比CAT及其他报告基因速度快；③比CAT灵敏100倍；④荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3．5小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。

用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。

构建负责表达荧光素酶的载体：在实验中，通常将感兴趣的基因调控区域与荧光素酶基因关联起来，构建成双荧光素酶报告基因的表达载体。这个基因构建过程通常通过分子克隆技术来完成。转染细胞：将上述构建好的表达载体引入目标细胞中。

双荧光素酶的璀璨光芒：基因检测的精准标尺/ 在生物科学研究的前沿，双荧光素酶报告基因检测系统如同两颗璀璨的星星，照亮了基因表达的复杂世界。它基于两种天然荧光酶——萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase， 61kDa）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase， 36kDa），构建出一套精密的实验平台。

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