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1. 载体构建时(以pet28a为载体,酶为EcoRI和XhoI)为什么会出现假阳性?

1、载体构建时(以pet28a为载体,酶为EcoRI和XhoI)为什么会出现假阳性?

你的质粒没有完全切开，可能还有完整的空载混在连接产物里面。这和你酶切的效率有关，考虑酶的质量、浓度、和酶切时间。甚至可能是单酶切的结果。2， 切下来的多克隆位点，你没有成功的分离出去，还混在你的连接体系里面，这样的话有一定的概率会重新连接回去。

如果是目的基因里面没有XhoI 和EcoRI的酶切位点，引物设计好了，应该不会出现移码的问题。

选择适合的载体是关键，PCI-neo因其常见的应用而备受青睐，但详情将在后续章节中详述（2）。在选择载体时，务必注意双酶切位点的选择，PCI-neo上如NheI、XhoI和EcoRI等，应挑选不在CDS区域且具有共同Buffer的两个酶，如XhoI和NotI，以避免干扰（4-8 图）。

如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。 Primer 5的使用 根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4TpET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。

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