本篇文章给大家谈谈载体构建中常用的克隆技术，以及载体和克隆载体对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站喔。 今天给各位分享载体构建中常用的克隆技术的知识，其中也会对载体和克隆载体进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！

1. 基因克隆的方法主要有哪几种?简述各种方法的原理和用途。
2. 试述常规重组载体构建的方法。
3. 基于无缝克隆技术构建基因敲除载体
4. 克隆技术

1、基因克隆的方法主要有哪几种?简述各种方法的原理和用途。

PCR扩增克隆法是在已知植物基因序列的基础上，进行基因序列克隆的一种方法。先从基因文库（genebank）中找到有关基因序列，据此合成一对寡聚核苷酸引物，从植物中提取染色体DNA或RNA，进行PCR扩增。

EASY克隆 EASY克隆的方法主要依赖于载体上所携带的拓扑异构酶。

提取目标基因：首先从目标生物体中提取需要克隆的基因，通常采用PCR或限制性酶切等方法来从基因组DNA中放大或切割出目标基因。 将目标基因克隆到载体上：将目标基因与载体（如质粒或病毒）进行连接，形成重组DNA。

这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体（质粒、噬菌体或病毒）中作序列测定或功能分析。

简单的说一下：扩增目的基因，比如通过PCR的方法。PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。

2、试述常规重组载体构建的方法。

目的基因是以生物基因组DNA为模板，设计引物，PCR出来的。目的产物的序列正确后，就可以构建重组载体。主要方法就是酶切目的产物，连接目标载体，转化大肠杆菌感受态，最后鉴定一下单克隆是不是阳性克隆就OK了。

选择合适的质粒载体：首先需要选择合适的质粒载体，考虑到外源基因的大小、表达强度和选择标记等因素。

载体构建目的 ①用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

目的基因制备和分离：一般通过文库筛选、同源序列比对等方法进行克隆。2）DNA重组载体的构建：选择植物表达载体，根据载体选择或添加酶切位点，然后进行酶切连接，构建重组载体。

先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。

3、基于无缝克隆技术构建基因敲除载体

ClonExpress技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 ClonExpressII 是新一代重组克隆试剂盒，包含增强的重组酶 ExnaseII。

无缝克隆技术的基本原理是利用PCR技术（聚合酶链式反应）在体外扩增目标序列，并加入诸如限制酶等基因工具，将扩增后的DNA片段粘接到载体上，构建达到需要的目的序列。

无缝克隆又叫同源重组，它可以将单个至多个片段同时插入到一个载体中，而不需要进行多次的酶切和纯化。通常情况下，无缝克隆可以在 515 min内完成多个片段的连接，其克隆阳性率高达 98% 以上。

无缝克隆的原理 首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。

无缝克隆反向设计引物方法如下：线性化目的载体：用酶切或是PCR方式；PCR获取目的片段。无缝克隆的原理首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibsonassembly和GoldenGateassembly。

4、克隆技术

研究克隆技术的目标是找到更好的办法改变家畜的基因构成，培育出成群的能够为消费者提供可能需要的更好的食品或任何化学物质的动物。

克隆技术是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因的个体或种群。

克隆技术指是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。克隆技术，是由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。克隆的英文“clone”源于希腊语的“kl”（嫩枝）。

每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃复性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。用途：对染色体步移技术、定位克隆技术、cDNA差显技术等方法的补充。

到此，以上就是小编对于载体构建中常用的克隆技术的问题就介绍到这了，希望介绍关于载体构建中常用的克隆技术的4点解答对大家有用。