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1. shRNA慢病毒载体合成步骤

1、shRNA慢病毒载体合成步骤

要进行shRNA载体构建，首先需要根据自己的基因，设计出对应的 靶点 、 loop序列 ， 酶切位点序列 ，详见 LncRNA的shRNA慢病毒载体引物设计 - 引物先用10000g在4°离心2min，再按照说明书的要求，加入DEPC或者无酶ddH2O将寡核苷酸稀释为100 μM。

方法依照shRNA设计原则，合成对应的shRNA序列，将其克隆到PHBLV载体中，使用三载体系统进行病毒包装，收集制备成功的病毒，并用荧光显微镜法测定病毒滴度，使用病毒感染EPC后，测定各组细胞中S1PR3蛋白表达情况，选择合适的病毒感染EPC后，测定其对EPC迁移能力的影响。

Tat是一种RNA结合蛋白，起到增强转录的作用。Nef蛋白抑制T细胞激活。Vpu能增强病毒进入过程中从细胞表面到细胞质中的释放。Vif蛋白是慢病毒复制所必须的，因为它能下调宿主的抗病毒反应 慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族。

慢病毒载体（Lentiviral vector， LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因（蛋白质编码序列、shRNA或gRNA）导入动物和人的原代细胞或细胞系。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

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