腺病毒载体构建cdna构建原理(腺病毒载体有毒吗)
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1、病毒包装的腺病毒
腺病毒(adenovirus )腺病毒颗粒没有包膜的直径为70~90nm的颗粒,由252个壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7~9nm。衣壳里是线状双链DNA分子,约含35 000 bp,两端各有长约100 bp的反向重复序列。
腺病毒呈无囊膜的球形结构,其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列,每个病毒颗粒包含一个36 kb的线性双链DNA,两端各有一个100~600 bp的反向末端重复序列(inverted terminal re-pea,t ITR), ITR的内侧为病毒包装信号,是病毒包装所需要的顺式作用元件。
腺病毒(Adenovirus)是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一,可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达shRNA或目的蛋白。其具备以下优点: 宿主范围广。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞,除可感染几乎所有人的细胞类型外,还可感染包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。
重组腺病毒的包装制备:重组腺病毒是从由侵染色斑组成单位(pfu)中分离获得的。一个单色斑是线性载体质粒转染后在20×15 cm板上由293A细胞连续侵染后被挑选和扩增形成的。重组腺病毒可通过超速离心纯化,并测定滴度及进行PCR鉴定。纯化后重组腺病毒的滴定浓度为1010pfu/ml,获得的量为2-4 ml。
腺相关病毒(AAV),这个看似微小却拥有强大潜力的病毒,属于细小病毒科的依赖病毒属。它身披无包膜的二十面体蛋白质衣壳,其基因组犹如精致的7 kb单链DNA舞者,以独特的生命循环在辅助病毒的陪伴下起舞。在辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒的引领下,AAV才能在宿主细胞的舞台上优雅地自我复制。
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