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1. 构建编码区点突变基因序列及表达载体实验全过程

1、构建编码区点突变基因序列及表达载体实验全过程

接下来，我们将探索构建一个野生型TNF-α真核表达载体的详细过程。构建TNF-α的遗传密码首先，从生物数据库下载TNF-α的完整序列，锁定编码区（CDS），如图5-8所示，这是实验的起始点。

为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容： 1添加5‘-3‘-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5‘-3‘-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。

重组表达质粒经EcoRI和KpnI双酶切后能产生出327bp、4980bp大小的两个片段，序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区，基因编码无移位，PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为35kD的融合蛋白。

在细胞中表达出的各种 mRNA 尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5；端非翻译区，中间的编码区和3；端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。

万bp的基因过表达可以通过过表达载体转染、基因突变来实现。过表达载体转染：将过表达载体导入目标细胞，使其表达目标基因，常用的载体有质粒、病毒等，转染后，可通过一系列实验方法，如Westernblot、RT-PCR等检测目标基因的表达水平。

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