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1. ...其中涉及的引物为什么要加酶切位点?难道不论载体都要加酶切位点吗...

1、...其中涉及的引物为什么要加酶切位点?难道不论载体都要加酶切位点吗...

获得目的基因后一般需要将目的基因连接到质粒载体上，在引物上加酶切位点可以使后续的连接过程简单、可控。因为可在载体和目的基因上酶切产生相同的切口。也有不需要加酶切位点的T载体，但连接过程效率不高还会有反向的错误连接。

这个不是必须的，要看你的实验要求。加酶切位点的目的是方便进行下面的克隆；如果你只是用于PCR鉴定等，添加酶切位点反而不好。

原理很简单，因为PCR扩增出来的产物都是你加进去的引物延伸出来的，所以PCR产物上都带你加进去的酶切位点。Btw：虽然你觉得你加进去的引物量很少，但是你可以算一下，你加进去了多少mol的引物，再用这个量乘以你的PCR目的产物的分子量，就可以知道你理论上能等到的产物的量了。

一般的PCR引物是不需要加酶切位点的，保护碱基是在需要加酶切位点的引物上加入的，加入保护碱基的目的，是为了使PCR产物在后续的实验过程中能够更有效的进行切割，当然有个别的内切酶不需要保护碱基就可以有效切割，但是一般的都需要加保护碱基，不同的内切酶需要的保护碱基的个数和种类也不同。

设计好引物后，分别在上下游引物的5’端加上你所需要引入的酶切位点就可以了。如果PCR产物需要酶切，就需要加上保护碱基。不同酶切位点所需要的保护碱基是不一样的，一般参考NEB网站上的一个保护碱基表。一搜就有了。

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